SISTEM HPLC -KIMIA AMAMI-

High-performance liquid chromatography

( HPLC)

Kromatografi cair kinerja tinggi ( sebelumnya disebut sebagai kromatografi cair tekanan tinggi ) , HPLC , adalah teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran , untuk mengidentifikasi setiap komponen , dan untuk mengukur masing-masing komponen . HPLC dianggap sebagai teknik instrumental kimia analitik ( sebagai lawan dari teknik gravimetri ) . Secara umum, metode ini melibatkan sampel cairan yang melewati bahan adsorben padat dikemas ke dalam kolom menggunakan aliran cairan pelarut . Setiap analit dalam sampel berinteraksi sedikit berbeda dengan bahan adsorben , sehingga memperlambat aliran analit . Jika interaksi lemah , analit mengalir dari kolom dalam waktu singkat , dan jika interaksi yang kuat , maka waktu elusi panjang . HPLC telah digunakan untuk medis (misalnya mendeteksi kadar vitamin D dalam darah serum ) , hukum ( misalnya mendeteksi obat peningkatan kinerja dalam urin ) , penelitian (misalnya memisahkan komponen dari sampel biologis yang kompleks , atau bahan kimia sintetis yang mirip satu sama lain ) , dan manufaktur ( misalnya selama proses produksi produk farmasi dan biologi ) tujuan . [ 1 ]

Kromatografi dapat digambarkan sebagai proses transfer massa yang melibatkan adsorpsi . HPLC bergantung pada pompa untuk lulus cairan bertekanan dan campuran sampel melalui kolom diisi dengan sorben , menyebabkan pemisahan komponen sampel . Komponen aktif kolom, sorben , biasanya bahan granular yang terbuat dari partikel padat ( misalnya silika , polimer , dll ) , 2-50 mikrometer dalam ukuran . Komponen campuran sampel terpisah satu sama lain karena derajat yang berbeda mereka interaksi dengan partikel sorbent . The bertekanan cair biasanya campuran pelarut ( misalnya air , asetonitril dan / atau metanol ) dan disebut sebagai " fase gerak " . Komposisi dan suhu memainkan peran utama dalam proses pemisahan dengan mempengaruhi interaksi yang terjadi antara komponen sampel dan sorben . Interaksi ini bersifat fisik , seperti hidrofobik ( dispersif ) , dipol - dipol dan ion , paling sering kombinasinya .

HPLC dibedakan dari tradisional ( " tekanan rendah " ) kromatografi cair karena tekanan operasional secara signifikan lebih tinggi ( 50-350 bar ) , sedangkan kromatografi cair biasa biasanya bergantung pada gaya gravitasi untuk lulus fase gerak melalui kolom . Karena jumlah sampel yang kecil dipisahkan dalam analisis HPLC dimensi kolom khas 2,1-4,6 mm diameter , dan panjang 30-250 mm . Juga kolom HPLC yang dibuat dengan partikel sorbent yang lebih kecil ( 2-5 mikrometer rata-rata ukuran partikel ) . Hal ini memberikan HPLC superior daya resolving ketika memisahkan campuran , yang mengapa adalah teknik kromatografi populer .

Skema dari instrumen HPLC biasanya mencakup sampler , pompa , dan detektor . Sampler membawa campuran sampel ke dalam aliran fase gerak yang membawanya ke dalam kolom . Pompa memberikan aliran yang diinginkan dan komposisi fase gerak melalui kolom . Detektor menghasilkan sinyal sebanding dengan jumlah komponen sampel muncul dari kolom , maka memungkinkan untuk analisis kuantitatif dari komponen sampel . Sebuah mikroprosesor digital dan pengguna perangkat lunak kontrol instrumen HPLC dan menyediakan analisis data . Beberapa model pompa mekanik dalam instrumen HPLC dapat mencampur beberapa pelarut bersama dalam rasio berubah dalam waktu , menghasilkan gradien komposisi dalam fase gerak . Berbagai detektor yang umum digunakan , seperti UV / Vis , fotodioda array ( PDA ) atau berdasarkan spektrometri massa . Kebanyakan instrumen HPLC juga memiliki oven kolom yang memungkinkan untuk menyesuaikan suhu pemisahan dilakukan pada .

Schematic representation of an HPLC unit. (1) Solvent reservoirs, (2) Solvent degasser, (3) Gradient valve, (4) Mixing vessel for delivery of the mobile phase, (5) High-pressure pump, (6) Switching valve in "inject position", (6') Switching valve in "load position", (7) Sample injection loop, (8) Pre-column (guard column), (9) Analytical column, (10) Detector (i.e. IR, UV), (11) Data acquisition, (12) Waste or fraction collector.

Skema representasi dari unit HPLC. (1) waduk pelarut, (2) Pelarut degasser, (3) Gradient valve, (4) Mixing kapal untuk pengiriman fase gerak, (5) pompa tekanan tinggi, (6) Switching katup "menyuntikkan posisi", (6 ') Switching katup dalam "posisi beban", (7) Contoh injeksi lingkaran, (8) Pre-kolom (kolom guard), (9) kolom Analytical, (10) Detector (yaitu IR, UV), (11) Data akuisisi, (12) Limbah atau fraksi kolektor

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. 

SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4)

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)

Fase gerak memiliki syarat sebagai berikut :

·           Murni, tanpa cemaran

·           Tidakbereaksi dengan kemasan

·           Sesuai dengan detector

·           Dapat melarutkan cuplikan

·           Mempunyai viskositas rendah

·           Memungkinkan memperoleh dengan mudah cuplikan jika diperlukan

2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6)

3. Tempat penyuntikan sampel (injector)
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. 

Posisi pada saat memuat sampel                 Posisi pada saat menyuntik sampel

Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu:

a. Stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, system tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

b. Septum : septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampa 60 – 70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan.

c. Loop vaive : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10µ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisikan ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom.

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

• Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
• Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
• Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).
Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. 

5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.2)

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut :

Detektor	Sensitifitas (g/ml)	Kisaran linier	Karakteristik
Absorbansi Uv-vis Fotometer filter Spektrofotometer spektrometer photo-diode array	5 x 10-10 5 x 10-10 > 2 x 10-10	104 105 105	Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh.
Fluoresensi	10-12	104	Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Indeks bias	5 x 10-7	104	Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien
Elektrokimia Konduktimetri Amperometri	10-8 10-12	104 105	Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda.

jenis – jenis detector

·         UV/Vis

·         Retraktif indeks (RI) detector

·         Konduktifitas decetor

·         Elektroimia detector

·         PDA

·         ELSD

·         MSdectetor

JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.3)

2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3)

3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2)

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.2)

DERIVATISASI PADA HPLC
Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi
2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik
3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik
4. Menstabilkan analit yang sensitif.5)

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.7)
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi.7)

Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :

Gugus fungsional	Reagen untuk dapat dideteksi dengan UV-Vis	Reagen untuk dapat dideteksi dengan Fluoresen
Asam-asam kaboksilat; asam-asam lemak;asam-asam fosfat	p-nitrobenzil-N,N’-diisopropilisourea (PNBDI); 3,5-dinitrobenzil-N,N’-diisopropilisourea (DNBDI); p-bromofenasil bromida (PBPB)	4-bromometil-7-asetoksikumarin; 4-bromometil-7-metoksikumarin;
Alkohol	3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).
Aldehid; keton	p-nitrobenziloksiamin hidroklorida (PNBA); 3,5-dinitrobenziloksiamin hidroklorida (DNBA);	Dansil hidrazin
Amin primer		Fluoresamin o-ftalaldehid (OPA)
Amin primer (1o) dan sekunder (2o)	3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); N-suksinimidil-p-nitrofenilasetat (SNPA); N-suksinimidil-3,5-dinitrofenilasetat (SDNPA); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).	7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F); Dansil klorida
Asam-asam amino (peptida)	4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsil-Cl)	Fluoresamin o-ftalaldehid (OPA) 7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F);

Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).

   Beberapa kegunaan dari HPLC :

·         HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.

·         Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair

·         Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

·         Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.

·         Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.

·         Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

·         Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.

   Kelebihan dan Kekurangan Dalam Penggunaan HPLC

Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi. Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:

·         Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi.

·         Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.

·         Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

·         Kolom dapat digunakan kembali.

·         Waktu analisa cukup singkat.

·         HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.

·         Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.

·         Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelebihan HPLC
Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan. Beberapa kelebihan KCKT diantaranya ialah
1. dapat dilaksanakan pada suhu kamar.
2. cepat dan mudah melaksanakannya.
3. peka, detektor HPLC dapat divariasi dan unik.
4. pelarut pengembang bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya.
5. ideal untuk molekul besar dan ion.
6. mudah memperoleh cuplikan.
7. daya pisahnya baik.
8. dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang di analisis.
9. HPLC juga dapat menganalisis senyawa yang tidak mudah menguap dan termolabil.

APLIKASI HPLC DALAM KEHIDUPAN
HPLC juga cocok digunakan untuk memisahkan minyak atsiri. Minyak atsiri terdiri atas campuran yang sangat rumit dan oleh karena itu HPLC berguna untuk memisahkan campuran rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponen-komponennya.
HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula. HPLC baik digunakan untuk senyawa yang dapat dideteksi di daerah spekrum UV atau spectrum sinar tampak.
Kolom yang tersedia mempunyai banyak sekali pelat teori (lebih dari 100.000 untuk kolom 100 cm), dan kromatografi dilakukan dalam kondisi mendekati kondisi ideal demikian rupa sehingga dapat diperoleh dalam beberapa menit dan ditafsirkan secara kuantitatif dengan ketepatan yang lumayan. Cuplikan dapat dipisahkan secara preparative.

 KESIMPULAN
• Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan analit berdasarkan kepolarannya, dengan fase diam berupa kolom dan larutan tertentu sebagai fase geraknya
• Instrumentasi HPLC yaitu:
1. Fasa Gerak
2. Pompa
3. Unit Sistem Penyuntikan atau Penginjeksian Sampel
4. Kolom
5. Detector
• Dibandingkan dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT atau HPLC = High Performance Liquid Chromatography) mempunyai beberapa kelebihan.
• HPLC digunakan untuk memisahkan golongan minyak, misalnya terpenoid tinggi, segala senyawa jenis fenol, alkaloid, lipid dan gula.